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茶树白化突变研究进展(二)

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三、组 学 技 术 在 白 化 茶 树 资 源 研 究 中 的 应 用
近些年来,随着各种组学技术的快速发展,将茶学的相关研究带入了一个新的高度。截至目前,已有2个茶树基因组草图相继发表,标志着茶学研究正式进入了后基因组时代,这为不同白化茶树分子机制的解析提供了新的研究方向。

1. 基因差异表达
基因差异表达作为功能基因组学的重要组成部分,是从RNA水平上研究生物体在不同组织结构、不同发育时期、不同环境条件下基因的表达情况。在白化资源的研究中,相关的分析方法已得到广泛应用。因白叶1号是较早发现的叶色变异资源,所以针对它的相关研究也最为系统,不同阶段的差异表达技术在这一资源上均有应用,如王新超等利用DDRT-PCR技术从白叶1号不同叶色新梢中获得58条差异表达片段,进一步通过RT-PCR分析,验证了12条阳性片段;Blastx序列比对发现,5个阳性片段分别与编码血红素结合蛋白、甲硫氨酸合酶、1-氨基环丙烷羧酸合酶等的基因序列高度相似。李娟利用SSH技术从白叶1号绿色叶和白化期叶片中分离80个差异表达基因,进一步分析筛选到1个可能调控白叶1号返白现象的钙调热激蛋白基因和2个与高氨基酸性状相关的丝氨酸-乙醛酸转氨酶、丝氨酸羟甲基转移酶基因。吴扬、Ruan等分别利用cDNA-AFLP技术从白叶1号不同叶色新梢中获得了31个和127条差异表达片段,对这些差异表达的基因进行同源序列比对发现,均与细胞周期、信号传导、物质和能量代谢等相关。

近些年,随着叶色变异资源的增多,基因差异显示技术也开始在更多的品种资源中得到应用(表1),如李娜娜等利用RNA-Seq法对福鼎大白茶和小雪芽叶片的差异基因进行了研究,筛选到1821个上调表达基因和1779个下调表达基因,进一步对差异基因进行GO和COG分析,认为引起小雪芽新梢白化的遗传机制可能与蛋白质翻译后修饰过程有关。Wu等利用RNA-Seq技术对白鸡冠的白化叶片和绿色叶片的差异表达基因进行研究,这些差异表达基因主要参与叶绿体发育、活性氧清除、光合色素合成、次级代谢和昼夜节律调控过程。一些科研人员也分别利用RNA-Seq技术研究了御金香、华白1号、黄金芽、炎陵银边茶等不同叶色时期的差异表达基因,结果发现差异表达基因同样参与了叶绿体发育、光合色素合成、次级代谢等过程。这说明虽然不同白化资源的遗传背景并不相同,但在基因表达层面上,叶绿体发育异常和叶绿素合成受阻是导致这类资源白化表型产生的直接原因。


2.蛋白质组学
蛋白质组学是以生物体内基因所表达的全部蛋白质为研究对象,从整体、动态的角度研究蛋白质特征,从而帮助科研人员从蛋白质水平上整体而全面地理解生物体的组织变化、物质代谢等过程。目前,基于双向凝胶电泳、质谱的蛋白质组学技术在白化茶树资源的研究中已得到初步应用(表2)。


3. 代谢组学
代谢组学可以通过定性或定量分析生物体在不同发育时期、不同组织结构、不同环境条件下代谢产物的变化情况,从而整体揭示生物体的代谢调控机制和生命活动规律。近些年来,研究者们利用代谢组学技术与多元统计分析相结合,发现不同叶色茶树品种之间、同一茶树品种不同叶色之间的代谢物变化均存在显著的差异(表3)。

目前,利用代谢组学技术研究白化茶树资源的代谢物变化,主要关注氨基酸、黄酮类和糖类等物质,而对香气物质的报道很少。根据已有研究,Dong等利用GC-MS技术分析了4月、8月和12月份英红9号白化叶片和绿色叶片中香气物质的变化,发现3个时期中白化叶片的顺-3-乙烯醇和芳樟醇含量均显著低于绿色叶片,其他香气物质含量变化不明显;这可能就是导致白化叶片中香气物质含量低于绿色叶片的直接原因。


四、分 子 标 记 技 术 在 白 化  资 源 研 究 中 的 应 用

随着测序技术的快速发展,也推动了DNA分子标记技术的广泛应用,与形态学标记、同工酶标记相比,DNA分子标记直接从基因组水平上研究生物的遗传变异,不受发育时期、环境因素的限制。目前分子标记技术在白化茶树资源研究中主要应用于遗传多样性分析、品种鉴定、遗传图谱构建及QTL定位等方面。王松琳等利用SSR分子标记对16个白化茶树品种进行遗传多样性分析,通过分析等位基因数、多态性信息含量和shannon值等,发现品种间遗传结构差异明显。并筛选出3对核心SSR引物,用于品种鉴定。王开荣等利用RAPD技术结合DNA序列测定,以福鼎大白茶为对照,研究黄金芽、千年雪、御金香、白叶1号、四明雪芽、金光和花月等7个白化品种的特异DNA分子标记,以期找到与白化相关的基因。通过对单一品种唯一扩增位点和缺失位点分析,发现一些位点可能与叶绿素代谢和抑制与叶绿素代谢相关基因的表达有关;进一步筛选了21个特异分子标记,并成功测序了4条DNA序列,通过Blast序列比对发现与蛋白激酶、转运蛋白家族基因等具有同源性;同时这一分子标记也可应用于白化茶树品种的遗传鉴定。吴永胜以白叶1号、黄金芽、御金香、四明雪芽等10份茶树资源为材料,先利用50对RAPD反应体系及程序进行PCR扩增,引物S20在御金香中扩增出1条特异性片段,之后在引物S20基础上设计SCAR引物SY20,用于扩增10份材料,发现该引物同样在御金香中扩增出特异性片段,表明了RAPD标记成功地转化为SCAR标记,并且利用该标记能够将御金香从多种茶树资源中鉴别出来。叶绿素、类胡萝卜素等色素物质直接影响茶树新梢叶片色泽,属于数量性状。为研究其遗传机制,王松琳以白鸡冠和龙井43作为父母本构建遗传群体,对亲本和子代个体测序获得大量SNP标记,结合拟测交策略构建遗传图谱,随后利用遗传图谱对叶绿素和类胡萝卜素这2个性状进行QTL作图,结果共定位了10个QTL,分布于4个连锁群上,表型贡献率在18.2%~72.0%,均为主效QTL。

 

五、 展望
综上所述,茶树白化现象的产生与细胞色素的合成和降解、光合系统、叶绿体的发育等密切相关。在生理水平上表现为叶绿体解体或退化消失,进而影响了叶绿素和类胡萝卜素等色素的生物合成;在生化成分上体现为含有较高含量的游离氨基酸;但是在分子水平上茶树的白化机理仍不明确。目前,虽也有部分参与叶绿素、类胡萝卜素、氨基酸合成相关的茶树基因得到了分离克隆,如邓婷婷等根据cDNA-AFLP的结果,利用RACE技术克隆了泛素活化酶基因和八氢番茄红素脱氢酶3基因;马春雷等根据芯片杂交结果,克隆了3个参与叶绿素合成途径的基因:谷氨酸-tRNA还原酶基因、叶绿素合酶基因、叶绿素醋酸氧化酶基因。但相关研究均属于同源克隆,因此到底是哪个基因的突变导致了白叶1号、黄金芽等白化突变体的白化表型问题仍未有答案。


从已报道的研究结果来看,在茶树白化突变体研究中还存在诸多亟待解决的问题。
首先,虽然近些年各地陆续发现了很多的白化茶树突变材料,但大多数资源的谱系关系和遗传背景均不清楚;以这些突变体为研究材料的相关研究也多集中在生理生化、基因表达和代谢层面,而缺少遗传层面的深入分析。
第二,因茶树是多年生木本植物,生长周期长,导致构建白化相关遗传群体的难度很大;而茶树基因组庞大,遗传位点高度杂合,使得茶树白化性状的遗传解析困难重重。
第三,因茶树转基因技术尚不成熟,很难通过本源表达验证基因功能,从而导致白化相关基因的鉴定很难开展。针对这些问题,课题组从2013年开始,对保存在国家种质杭州茶树圃的十几份白化茶树资源的遗传特性进行了连续多年的观察,发现这些资源中的大多数都具有叶色遗传规律,如黄金芽、白鸡冠、安吉黄茶、中黄1号等(表4)。

随后课题组以其中3个具有叶色遗传特性的白化资源为父本,通过多年的连续杂交,已建立了3个白化性状在子代中能有效分离的F1群体,这些遗传群体将是以后解答白化茶树资源叶色突变机制的重要研究材料。

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